Una densità crescente della cella HT1080 viene semi-utilizzata (1-20 K / pozzetto) e trattata con Incucyte® FabFluor marcato α-CD71 (4 μg / mL).

Sartorius iQue3 è una di quelle piattaforme ampiamente utilizzate dalla libreria anticorpo ad alto contenuto.

Con la potente tecnologia che lo utilizza, tutto drasticamente ridicolo a causa dell’antigene e del reagente, il robusto strumento di analisi consente di identificare rapidamente la qualità del successo e tutto il tempo richiesto dall’antitumorale.

Riferimenti

1. Chames, P., et al. (2009) “Anticorpi terapeutici: successi, limiti e speranze per il futuro.” British Journal of Pharmacology 157: 220-233.
2. Ecker, D.M., et al. (2015) “Il mercato degli anticorpi monoclonali terapeutici.” mAb 7: 9-14.
3. Black, C.B., et al. (2011) “Screening Cell-Based Using High-Throughput Flow Citometry”. Tecnologia di analisi e farmacia 9: 13-20.

Sartorius

Sartorius è il leader internazionale nella fornitura di prodotti farmaceutici e di laboratorio. Con il nostro prodotto e servizio innovativo, stiamo assistendo il nostro cliente nell’implementazione del processo produttivo e di un laboratorio completo e qualitativamente critico in modo economico ed affidabile.

La società del Gruppo sono riunite sotto il tetto di Sartorius AG, è quotata alla Borsa di Francoforte e detiene la quota della grande Sartorius Stedim Biotech S.A.

Consenso tecnologico innovativo senza progresso medico

Un numero crescente di biofarmacie. Ho richiesto prodotti che utilizzino cellule viventi nelle procedure Ampura, Lunghe e Costose. La divisione Bioprocess Solutions fornisce e produce tecnologia essenziale ai fini del risultato.

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Render più facile la vita in laboratorio

Il lavoratore del laboratorio è completo e impregnativo: non contenendo la routine analitica ripetitiva, la persona del laboratorio deve ogni passaggio in maniera altamente concentrata e attenta al rischio con precisione.

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Gli anticorpi monoclonali sono usati e agenti terapeutici antinfiammatori, antitumorali e antivirali.dietonus su amazon La posizione, il momento e la velocità di interiorizzazione nella cellula dormono molto importanti come proprietario dell’anticorpo.

L’anticorpo farmacologico (ADC) distribuito come risultato della citotossicità nella cellula con la specificità dell’assorbimento cellulare cruciale per efficienza e il chiodo molecolare.

Inoltre, dormi utilizzando tutta l’immunoterapia interna per il tumore cellulare eliminando la cellula immunitaria (ADCC ad hoc, ADCP (1, 2, 3)), basta venire guidando l’internalizzazione dei recettori legati alla sopravivenza del tumore (ad esempio EGFR (4, 5)).

La velocità della superficie cellulare darà una notevole considerazione al tuo profilo terapeutico.

L’interiorizzazione degli anticorpi da parte di meccanismi specifici o non specifici (ad es. Pinocytosi nelle cellule endoteliali) costituiscono un determinante chiave del corpo e dell’ancora e dei canali sottili alla struttura della durata dell’attività.

In effetti, ho una passione per l’acquisizione di una chiara compresa nell’interiorizzazione degli anticorpi nelle cellule. È importante contrastare la diversità degli antibiotici nella selezione degli anticorpi, poiché consente la farmacia biologica.

Il metodo utilizzato per quantificare direttamente la politica internazionale di rischio è del tutto laborioso, ricco, non troppo lungo e non troppo tardi per testare contemporaneamente l’anticorpo. Questa domanda chiedeva la ricchezza dell’anticorpo con un tag fluorescente e in quasi tutti quesi l’antiborpo marcato deve quindi essere separato dall’etichetta libera attraverso una fase di lavaggio o colonna.

Una corretta analisi implica che l’anticorpo interno sia isolato dal violoncello in tutta la cellula. Una garanzia di bloccanti colori, lavaggio e / o trabocco della temperatura per rallentare l’attività cellulare.

Praticamente tutte le approssimazioni questi (ad es. Fluss cytometry, imaging ad high contenuto) offrono solo saggi end point, poiché il sonno avrà bisogno di numeri ed esperienza per il tempo interiore.

Questo white paper delinea l’approvazione per il problema limite: una soluzione dell’analisi di base delle cellule vive Incucyte®, mi inserisce in un nuovo quadro della parte anticorpo con colorante a pH sensibile (Incucyte® FabFluor Antibody Label).

Questa soluzione innovativa prevede un semisolido e chiavi in ​​mano per valorizzare l’internalizzazione di un numero significativo di anticorpi. Si basa su basi scientifiche e sull’uso nel processo di scoping degli anticorpali industriali farmaceutici.

Principio di analisi

Reagente per il test degli anticorpi Incucyte® FabFluor sono frammenti Fab che attivano la regione Fc e non sono collegati una sonda fluorescente pH-sensitive. Ho messo in dubbio il consenso di un protocollo generale di etica in un’unica fase, mediante lavaggio, da parte del gamma dell’anticorpo del test di contesa Fc con matching isotipico.

A pH 7,0, il complemento Fab-Ab ha una fluorescenza che limita la dipendenza aggiunta. Tuttavia, quando gli antibiotici marcati vengono aggiunti alle cellule, potrebbero essere chiusi con un segmento fluorogenico all’interno del Fab-Ab vene interiorizzato e quindi elaborare endosomi e lisosomi acidi (pH 4,5-5,5) (Figura 1).

Figura 1. Principio del test anticorpale interno utilizzando il reagente dell’etichettatura Incucyte® FabFluor. (ONU). Il segmento fluorogenico mangia l’anticorpo fluoruro interno e lo prepara nel lisosoma acido. Mostrerò la sensibilità della sonda pH (B e C). Notare la fluorescenza rispetto a FabFluor a pH 7.0. Credito immagine: Sartorius

Il corso completo dell’internalizzazione viene quantificato e visualizzato dall’analisi delle cellule in real time Incucyte®. Era il metodo di incisione e filo interdentale del test del sonno ideale per il valore e l’interiorizzazione dell’anticorpo (10-100 s) in formato pizza in miniatura (96/384 pozzetti).

Guida veloce

Credito immagine: Sartorius

Metodi e materiali generali

Raccogli cellulari e reagenti

Poi dormo stati coltivati ​​in beute da 75 cm2 trattare con coltura tissutale: cellule BT-474 (DMEM + 10% FCS), cellule HT1080 (F12K + 10% FCS, 1% glutamax, 1 u / mL pen / strep) , cellule Jurkat e Raji (tra RPMI 1640 + 10% FCS).

La cella lineare è uno stato ATCC con il reagente Life Technologies. Il test antibiotico disponibile in commercio include CD71 clone 1a, 2, CD20 (Sigma), clone 3-5 (Abcam), CD3, CD45 (Biolegend), controllo dell’isotipo IgG umano (Absolute Antibody), controllo dell’isotype IgG1 murine (sistemi RD).

Etichettatura degli anticorpi

Notevole concentrazione dell’anticorpo nella sua condizione miscellanea con il reagente Incucyte® FabFluor isotipico in un terreno a piena crescita, utilizzando un rapporto molare da 1 a 3.

Le reazioni sono state esguite al doppio della concentrazione finale richiesta per il test e incubate per 15 minuti a 37 ° C. Questa domanda utilizza una microprovetta ambrata a 96 pozzetti in uno sfondo profondo (Costar # 3799) e una seconda dei volumi richiesti.

Laddove saranno necessarie dilizioni (ad es. Per creare curve di risposta alla concentrazione), per quanto riguarda lo stato di sonno si tratta di mantenere il rapporto di etichettatura. Successivamente, il marchio dell’anticorpo con FabFluor (50 μl) arriva direttamente alla cella pre-placcato (in 50 μl).

Incucyte® internalizzazione degli anticorpi

Le cellule sono state piastrate (BT-474 10K per pozzetto, 16 ore, HT1080 8K per pozzetto, 4 ore) su piastre to 96 pozzetti in depth piatto (Costar # 3595) prima del dosaggio.

Laddove i saggi utilizza tipi cellulari non aderenti, le piastre sono state rivestite con poli-L-ornitina (PLO, Sigma P4957) per 1 aa, seguito da 30 minuti di essiccazione prima che avvenisse la semina cellulare.

Il cellulare dorme seminato a 30 K / pozzetto, per il momento del dosaggio. A volt Ab / Fab combinato, il sistema sonoro completo del iv collocato del sistema di analisi delle cellule vive Incucyte® S3, vene prima scansionato con fluorescenza rosa e ripreso in fase HD. Grazie per esserti unito a 10x o 20x o 15-30 minuti per una messa di 48 ore.

L’immagine viene analizzata utilizzando Incucyte® integrato e software automatizzato dalla sequenza della confluenza di fase (misura dell’area cellulare) e dalla fluorescenza rossa (brand index antibody internalizzato con FabFluor). Il Top Hat è una buona indicazione della qualità dello sfondo fluorescente.

Dati di validati

Controlla la teoria

L’anticorpo di controllo interno CD71 – il caso di trasferimento – è una mancata corrispondenza nella cellula di fibrosarcoma HT1080. L’anticorpo anti-CD71 (clone MEM189) è un controllore per l’IgG1 dello stato superiore con l’IgG1 dell’IgG1 della rosetta superiore Incucyte® FabFluor rosso corrispondente all’isotipo.

Gli antibiotici marcati con FabFluor (4 μg / mL) sleep sono stati aggiunti tutte le cellule ed in questione come stato che utilizza un sistema di analisi delle cellule vive Incucyte® S3 per preservare la fluorescenza rossa e il suo contrasto di fase per 12 ore.

Con l’anti-CD71 abbiamo notato un rapido e variabile aumento del tempo di fluorescenza rossa, ma non il tipo o il controllo del mezzo. Ciò è il primo primo punto temporale (15 minuti) test (Figura 2).

Figura 2. Interiorizzazione di Incucyte® FabFluor marcato con α-CD71 nella cella HT1080. La cellula T1080 viene trattata con Incucyte® FabFluor Marcate con α-CD71 o il controller dell’isotipo IgG1 (4 μg / mL), la fase HD e l’immagine fluorescente rossa (10x) dello stato di sonno acquisite ogni 15 min in 12 h . L’immagine cellulare trattata con FabFluor-α-CD71 nella fluorescenza citosolica rossa (A). La cellula è un trattamento con il controllo non fluorescente della marcia cellulare (B). I dati’andamento temporale hanno evidenziato un rapido aumento nel tempo dell’area rossa nel trattamento delle cellule con etichettate α-CD71 con controllore isotipico (C). Imagini mostra scattate 6 ore il trattamento, i dati mostrano come media di 3 pozzetti ± SEM. Credito immagine: Sartorius

Tutti e 12, il segnale: lo sfondo del test è> 15 indietro. Il segmento è il rilevate nel compartimento citosolico della cellula ma non è il nucleo nel nucleo. Era in linea con la localizazione anticipata dell’antibor interiorizzato contro lisoomi e gli endosomi. L’area di fluorescenza (µm2 / pozzetto) viene utilizzata per quantificare il segmento specifico.

Normalizzazione per numero di cella

Teoricamente, il segmento di internalizzazione dell’antibor dovrebbe aumentare in funzione del numero di cellule. Il convegno di scienza, e per comprensibile il contributo della proliferazione cellulare al tempo, sonno stati effettuatiati sperimenti le su cellule piastte a varie densità (1-20 K per pozzetto).

L’internalizzazione dell’anti-CD71 (area rosa fluorescente) è resistente a 1 K cellule per pozzetto e aumenta la densità delle maggiori placcatura (Figura 3 A e B). Al momento (0-12 ore) il mercato internazionale della pizza continua ad aumentare.

Figura 3. Il rischio interno dell’anticorpo dipende da cellero numero. È un prodotto della densità crescente della cellula HT1080 (1-20 K / pozzetto) e trattato con Incucyte® FabFluor Marcate α-CD71 (4 μg / mL). L’ho ripreso in fase HD e in fluorescenza rossa (10x) sono state acquisite ogni 30 min in 12 h. L’arredamento dell’epoca mi ha dato il ross mostra un segmento di internalizzazione crescente all’aumentare del numero di cellula (A e B). Quando il secondo creato rosso è normale per il palcoscenico, è la dimensione del layout interno che dipende dal numero di celle (C e D). Tutti e dati sono showa con un media di 3 pozzetti ± SEM, e il grafico a barre mostra l’area sotto la curva (AUC) calcolata da dati dell’andamento del tempo. Credito immagine: Sartorius

Quando l’area di fluorescenza è normale, tutta l’area della cellula (confluenza della fase) appartiene alla proliferazione e quindi al corso temporale erano molto simili.

È importante notare che non è necessario aumentare l’intervallo normale. Ciò indica che le lizzie degli antibiotici hanno il giusto equilibrio. Questa valutazione di ogni normalizzazione ha consentito il minimo ridicolo della simpatia del seminario cellulare dal pozzetto al pozzetto e l’isolamento della velocità dell’internalizzazione reale dalla proliferazione cellulare.

Co-localizzazione del segnale con marker lisosomiale

La fine giornata verificata la presenza dell’anticorpo interno all’interno del lisosoma, funzionerà con una doppia etichettatura con marker dell’end-point lisosomiale, il LysoSensor® Green (Thermo Scientific).

Le cellule HT1080 sono state trattate con CD71 contrassegnate con FabFluor per 3 ore e osservate per l’internalizzazione degli anticorpi. LysoSensor Green è uno status premium per il pellet reinserito nell’Incucyte® a causa della fluorescenza verde (LysoSensor) e rossa (CD71).

Una segmentazione robusta è lo stato dovuto alla canalizzazione. Il 74% del rosso è una condizione co-localizzata con il verde, aiutando il negozio con il Fab-Fluor ad essere interiorizzato al lisosoma.

Figura 4. Co-localizzazione di Incucyte® FabFluor etichettate α-CD71 e Lyso Sensor® Green in cellule HT1080. L’Internalizzazione di Incucyte® FabFluor Marcate α-CD71 (4 μg / mL) è stabile per 3 h nella cella HT1080 prima dell’aggiunta di LysoSensor® Green DND-189 (Thermo, 0.25 μM). L’immagine mostrava il segnale rosso α-CD71 marcato con LysoSensor® Green e FabFluor (A e B), la co-localizzazione dei segnali rosso e verde (C) e la maschera di analisi co-localizzata mostra in giallo (D). (E) L’analisi di Incucyte® della coincidenza della fluorescenza rossa e verde conferisce la co-locazione del 74% del segmento rosa con il segmento verde. Immagini acquisite con ingrandimento 20x, 30 min dall’Aggiunta di LysoSensor®, dati riportati ea media di 4 pozzetti ± SEM. Credito immagine: Sartorius

Applicabilità tra diversi tipi di cellule e anticorpi

Alla data di applicazione della domanda e alla specificità del metodo in questione, vale la pena per la serie di anticorpi nel miri test contro specifici marker CD, espressi in linea variabile e cellulare (Figura 5).

Figura 5. Interiorizzazione degli anticorpi mirati al marker della superficie CD su quella linea cellulare linfocitica. Le cellule Jurkat (simile a cellule T) e Raji (simile a cellule B) (30 K / pozzetto) sono state trattate con diversi anticorpi anticorpali con Incucyte® FabFluor (4 μg / mL). Phase HD e imaging rosse sono state acquisite ogni 30 minuti utilizzando una lente 20x in 12 ore. I dati di tempo temporale (A e B) e l’analisi dell’area under the curve (AUC, C) hanno mostrato il profilo della risposta tra la linea cellulare. Tutto lo spettacolo del sonno con una media di 4 pozzetti ± SEM, dormo a tempo nello spettacolo del sonno con la normale zona pizza. Credito immagine: Sartorius

È interiorizzato nella linea cellulare B Raji, ma non nella linea cellulare T Jurkat. Al contrario, l’anti-CD3 è una condizione interna in Jurkat ma non in Raji. Ato stato osservato che gli anticorpi contro CD71 e CD45 – marcatori lymphocytari generali – sono stati interiorizzati in entrambi i tipi di cellule.